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写在前面

我们前段时间，分享了Linux中部署及使用Codex教程,若是在本地部署，也非常容易。我们直接使用Codex的API密匙即可完成部署。

对于Codex的理解和编程能力，可能未使用的人对此还是有比较大的疑惑。me too。

本期，分享一套基于Codex协助完成的泛基因组分析流程代码。

注：本套代码仅供参考学习。

若要获得本期教程数据和代码，在后台回复：20260624

结果如下

1. 项目结构

pangenome_tutorial/
├── README.md
├── docs/
│   └── pangenome_workflow.md
├── env/
│   └── pangenome_env.yml
├── script/
│   ├── 00_create_env.sh
│   ├── 01_download_public_data.sh
│   ├── 02_genome_qc_from_public_assemblies.sh
│   ├── 02_qc_trim_assemble.sh
│   ├── 03_polish_and_correct.sh
│   ├── 04_annotate.sh
│   ├── 05_run_pangenome.sh
│   ├── run_r_analysis.sh
│   └── run_r_analysis_from_existing_matrix.sh
├── R/
│   ├── 01_generate_demo_data.R
│   ├── 02_pangenome_analysis.R
│   ├── 03_plot_figures.R
│   └── 04_import_roary_panaroo.R
├── data/
│   ├── metadata/
│   └── pangenome/
└── results/
    ├── figures/
    └── tables/

2. 研究对象与公开数据来源

1.1 参考文献

Tettelin 等 2005 年发表的 S. agalactiae 研究对多个致病菌株进行比较基因组分析，指出单个参考基因组不能代表物种内全部遗传多样性，并提出 pan-genome 的思想。文章摘要中报告，该物种的核心基因组约占单个基因组的 80%，其余为不同菌株间差异明显的附属基因组。

本教程的数据表位于：

data/metadata/tettelin_2005_accessions.tsv
data/metadata/publication.tsv

tettelin_2005_accessions.tsv 中列出了用于示例重分析的 8 个基因组入口：

菌株 accession 类型 说明
18RS21 AAJO01000000 WGS master Tettelin 2005 新沉积
515 AAJP01000000 WGS master Tettelin 2005 新沉积
CJB111 AAJQ01000000 WGS master Tettelin 2005 新沉积
COH1 AAJR01000000 WGS master Tettelin 2005 新沉积
H36B AAJS01000000 WGS master Tettelin 2005 新沉积
A909 CP000114 complete chromosome Tettelin 2005 新沉积
NEM316 AL732656 complete chromosome 已公开数据库基因组
2603V/R AE009948 complete chromosome 已公开数据库基因组

1.2 两种可运行入口

由于该经典文章公开沉积的是组装后的 WGS/染色体序列，而不是现代 Illumina FASTQ 原始读段，本教程将流程分为两条入口。

入口 A：复现文献公开基因组数据

cd pangenome_tutorial
bash script/01_download_public_data.sh
bash script/02_genome_qc_from_public_assemblies.sh

入口 B：新项目或 SRA FASTQ 原始读段

cd pangenome_tutorial
cp data/metadata/samples_template.tsv data/metadata/samples.tsv
# 编辑 data/metadata/samples.tsv，使 fq1/fq2 指向真实 fastq.gz 文件
bash script/02_qc_trim_assemble.sh
bash script/03_polish_and_correct.sh
bash script/04_annotate.sh
bash script/05_run_pangenome.sh

2. 软件环境构建

所有软件安装定义在 env/pangenome_env.yml 中。推荐使用 mamba，因为生物信息依赖较多。

cd pangenome_tutorial
bash script/00_create_env.sh
conda activate pangenome_env

该环境包含：

类型 软件
数据下载 entrez-direct, ncbi-datasets-cli, sra-tools
原始 reads 质控 FastQC, fastp, MultiQC
组装与评估 SPAdes, QUAST, CheckM
矫正 BWA, SAMtools, Pilon
注释 Prokka, Bakta
泛基因组 Panaroo, Roary, MAFFT, FastTree
R 分析和绘图 R, ggplot2, tidyverse, ape, vegan, pheatmap

Bakta 和 CheckM 需要额外数据库。真实项目建议把数据库放在项目目录下，例如：

mkdir -p data/db
bakta_db download --output data/db/bakta
export BAKTA_DB="$(pwd)/data/db/bakta/db"

mkdir -p data/db/checkm
checkm data setRoot data/db/checkm

3. 数据下载

3.1 文献公开基因组下载

script/01_download_public_data.sh 读取 data/metadata/tettelin_2005_accessions.tsv，使用 Entrez Direct 从 NCBI nucleotide 数据库下载 FASTA 和 GFF3。

bash script/01_download_public_data.sh

输出：

data/raw/genomes/*.fna
data/raw/genomes/*.gff3
logs/downloaded_genome_stats.tsv

3.2 原始 FASTQ 项目的样本表

如果分析新测序项目或 SRA 下载后的 reads，准备如下样本表：

sample_id    fq1                                      fq2
sample_01    data/raw/reads/sample_01_R1.fastq.gz     data/raw/reads/sample_01_R2.fastq.gz
sample_02    data/raw/reads/sample_02_R1.fastq.gz     data/raw/reads/sample_02_R2.fastq.gz

本项目提供模板：

cp data/metadata/samples_template.tsv data/metadata/samples.tsv

4. 质控、修剪与组装

原始 reads 质控由 script/02_qc_trim_assemble.sh 完成。该脚本对每个样本执行：

  1. FastQC：检查原始 reads 质量。
  2. fastp：去接头、低质量端修剪、过滤过短 reads。
  3. FastQC：检查修剪后 reads。
  4. SPAdes --careful：进行细菌基因组短读长组装。
  5. QUAST：评估 contig 数量、N50、总长度、GC 等指标。
  6. MultiQC：整合质控报告。
bash script/02_qc_trim_assemble.sh

推荐初筛阈值：

指标 建议阈值 解释
Q30 比例 大于 80% 低于该值说明测序质量偏差，需要谨慎
adapter 含量 小于 5% 高接头比例会影响组装
reads 数 每个基因组 50 倍以上覆盖度更稳妥 细菌组装通常需要足够覆盖
contig N50 越高越好 与数据质量和重复序列有关
contig 数 越少越好 过多 contig 可能导致泛基因组假阳性
总长度 接近物种预期 明显偏大可能污染，偏小可能缺失
CheckM completeness 大于 95% 代表基因组较完整
CheckM contamination 小于 5% 高污染会夸大 pan-genome

5. 基因组矫正与过滤

组装后使用 reads 回贴到 contig，通过 Pilon 矫正小 indel、替换和局部错误。

bash script/03_polish_and_correct.sh

脚本步骤：

  1. BWA index：为 contig 建索引。
  2. BWA MEM：将修剪后 reads 比对回组装结果。
  3. SAMtools sort/index：整理 BAM。
  4. Pilon：根据 read alignment 矫正组装。
  5. seqkit：过滤小于 500 bp 的短 contig。

矫正后的文件位于：

results/polished/<sample>/<sample>.polished.min500.fna

质量控制要点：

  • 同一项目内所有样本必须采用同一组装、过滤和矫正策略。
  • 不建议把完成图基因组、草图基因组、不同测序平台结果不加说明地直接混合。
  • 若泛基因组中 singleton 异常偏多，应优先检查污染、碎片化和注释一致性，而不是直接解释为生物学差异。

6. 基因组注释

泛基因组分析依赖基因预测和功能注释。不同注释器会改变 CDS 边界和基因数量，因此同一个项目必须统一注释流程。

bash script/04_annotate.sh

默认执行 Prokka，若设置 BAKTA_DB 则同时执行 Bakta。

Prokka 输出：

results/annotation/prokka/<sample>/<sample>.gff
results/annotation/prokka/<sample>/<sample>.faa
results/annotation/prokka/<sample>/<sample>.ffn

推荐实践：

  • 泛基因组聚类使用同一注释器产生的 GFF。
  • 发表时报告注释软件版本、数据库版本和关键参数。
  • 物种名、菌株名、locustag 应统一且不包含空格。

7. 泛基因组构建

本项目同时给出 Panaroo 和 Roary。Roary 是经典工具，适合快速得到基因 presence/absence 矩阵；Panaroo 更强调错误基因、碎片基因和图结构清理，适合对草图组装进行稳健分析。

bash script/05_run_pangenome.sh

核心参数：

panaroo \
  -i *.gff \
  -o results/pangenome/panaroo \
  --clean-mode strict \
  --remove-invalid-genes \
  -a core

roary \
  -e --mafft \
  -p 16 \
  -f results/pangenome/roary \
  *.gff

常见结果文件：

文件 来源 用途
gene_presence_absence.Rtab Panaroo/Roary R 绘图和统计矩阵
gene_presence_absence.csv Panaroo/Roary 含注释的宽表
core_gene_alignment.aln Panaroo/Roary 核心基因系统发育
summary_statistics.txt Panaroo/Roary pan/core/shell/cloud 摘要

8. R 语言下游分析与绘图

8.1 演示数据

本教程已生成可直接运行的演示矩阵：

data/pangenome/gene_presence_absence_demo.tsv
data/pangenome/gene_family_annotation_demo.tsv
data/pangenome/per_genome_gene_counts_demo.tsv

生成、分析和绘图：

bash script/run_r_analysis.sh

该命令依次运行：

R/01_generate_demo_data.R
R/02_pangenome_analysis.R
R/03_plot_figures.R

8.2 导入真实 Panaroo/Roary 矩阵

真实项目跑完 Panaroo 后，导入矩阵：

Rscript R/04_import_roary_panaroo.R "$(pwd)" results/pangenome/panaroo/gene_presence_absence.Rtab
bash script/run_r_analysis_from_existing_matrix.sh

如果使用 Roary 输出：

Rscript R/04_import_roary_panaroo.R "$(pwd)" results/pangenome/roary/gene_presence_absence.Rtab
bash script/run_r_analysis_from_existing_matrix.sh

8.3 R 分析内容

R/02_pangenome_analysis.R 完成以下统计：

  • 计算每个 gene family 在多少个基因组中出现。
  • 分类为 Core、Soft-core、Shell、Cloud。
  • 统计每个样本的核心与附属基因数量。
  • 通过 200 次随机基因组加入顺序估计 pan/core 累积曲线。
  • 计算 gene presence/absence 的 Jaccard 距离。
  • 用平均连接法构建附属基因组聚类树。
  • 汇总功能类别在不同泛基因组组分中的分布。

输出表格：

results/tables/pangenome_class_summary.tsv
results/tables/per_genome_gene_family_counts.tsv
results/tables/pan_core_accumulation_curves.tsv
results/tables/gene_prevalence_distribution.tsv
results/tables/jaccard_distance_matrix.tsv
results/tables/functional_class_by_pangenome_class.tsv
results/tables/accessory_gene_jaccard_tree.nwk

9. 图件索引与图注

所有图件均同时输出 jpg 和 pdf：

图号 文件 源数据 绘图脚本 图意
Figure 1 results/figures/Figure1_pangenome_composition.jpg/.pdf pangenome_class_summary.tsv R/03_plot_figures.R 核心、软核心、壳层和云基因数量
Figure 2 results/figures/Figure2_pan_core_accumulation.jpg/.pdf pan_core_accumulation_curves.tsv R/03_plot_figures.R pan-genome 和 core-genome 随基因组数量变化
Figure 3 results/figures/Figure3_gene_prevalence_distribution.jpg/.pdf gene_prevalence_distribution.tsv R/03_plot_figures.R gene family 在样本中的流行度分布
Figure 4 results/figures/Figure4_per_genome_gene_content.jpg/.pdf per_genome_gene_family_counts.tsv R/03_plot_figures.R 单个基因组的核心和附属基因数量
Figure 5 results/figures/Figure5_accessory_jaccard_clustering.jpg/.pdf jaccard_distance_matrix.tsv R/03_plot_figures.R 附属基因组 Jaccard 距离聚类
Figure 6 results/figures/Figure6_functional_class_distribution.jpg/.pdf functional_class_by_pangenome_class.tsv R/03_plot_figures.R 功能类别在不同泛基因组组分中的分布

示例图注可直接作为报告模板：

Figure 1. Pangenome composition of the analyzed isolates. Gene families were classified by prevalence across genomes into core, soft-core, shell and cloud compartments. The current figure was generated from the demonstration matrix and should be regenerated from the project-specific Panaroo/Roary matrix before publication.

Figure 2. Pan-genome and core-genome accumulation curves. Genomes were randomly permuted 200 times. Lines represent mean gene-family counts, and shaded intervals represent empirical 95% ranges.

Figure 3. Gene-family prevalence distribution. The x-axis indicates the number of genomes carrying a gene family. Gene families found in all genomes contribute to the core genome, whereas low-prevalence families define the accessory gene reservoir.

Figure 4. Per-genome gene-family content. Bars show core and accessory gene families per genome. Outliers should be inspected for assembly fragmentation, contamination or annotation bias.

Figure 5. Accessory genome clustering. Jaccard distance was calculated from the binary gene presence/absence matrix and clustered by average linkage. Clustering reflects accessory gene content similarity rather than SNP-level phylogeny.

Figure 6. Functional distribution across pangenome compartments. Functional classes summarize the annotation composition of core and accessory compartments. Enrichment of mobilome, defense or unknown-function genes in accessory compartments is common in bacterial pan-genomes and should be interpreted together with gene quality and annotation evidence.

若要获得本期教程数据和代码，在后台回复：20260624

10. 参考文献

  1. Tettelin H, Masignani V, Cieslewicz MJ, et al. Genome analysis of multiple pathogenic isolates of Streptococcus agalactiae: implications for the microbial pan-genome. PNAS, 2005. PMID: 16172379. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16172379/
  2. PMC 开放全文和数据沉积说明。https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC1216834/
  3. Seemann T. Prokka: rapid prokaryotic genome annotation. Bioinformatics, 2014. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24642063/
  4. Page AJ, Cummins CA, Hunt M, et al. Roary: rapid large-scale prokaryote pan genome analysis. Bioinformatics, 2015. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26198102/
  5. Tonkin-Hill G, MacAlasdair N, Ruis C, et al. Producing polished prokaryotic pangenomes with Panaroo. Genome Biology, 2020. https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-020-02090-4
  6. Chen S, Zhou Y, Chen Y, Gu J. fastp: an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor. Bioinformatics, 2018. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30423086/
  7. Bankevich A, Nurk S, Antipov D, et al. SPAdes: a new genome assembly algorithm. Journal of Computational Biology, 2012. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22506599/
  8. Gurevich A, Saveliev V, Vyahhi N, Tesler G. QUAST: quality assessment tool for genome assemblies. Bioinformatics, 2013. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23422339/
  9. Walker BJ, Abeel T, Shea T, et al. Pilon: an integrated tool for comprehensive microbial variant detection and genome assembly improvement. PLoS ONE, 2014. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25409509/
  10. Parks DH, Imelfort M, Skennerton CT, Hugenholtz P, Tyson GW. CheckM: assessing the quality of microbial genomes recovered from isolates, single cells, and metagenomes. Genome Research, 2015. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25977477/
  11. Schwengers O, Jelonek L, Dieckmann MA, et al. Bakta: rapid and standardized annotation of bacterial genomes. Microbial Genomics, 2021. https://doi.org/10.1099/mgen.0.000685

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