Microbiome|中科院深圳先进院马迎飞团队通过宏基因组分析揭示了三种哺乳动物模型中的肠道病毒的多样性

刘永鑫Adam

241人浏览 · 2025-12-09 08:04:35

刘永鑫Adam · 2025-12-09 08:04:35 发布

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编译：微科盟洒脱点，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读

背景：肠道病毒组在塑造宿主微生物群中起着关键作用。然而，不同哺乳动物模型中的肠道病毒及其与人类肠道微生物群的联系在很大程度上仍是未知。

结果：研究者从宏基因组中分别鉴定小鼠（hcMGV）、猪（hcPGV）和食蟹猴（hcCMGV）肠道的977个、12896个和1480个高置信度种水平病毒操作分类单元（vOTUs）。研究者将这些vOTUs在属水平聚类后，发现在动物肠道中高度流行（≥60%）的新进化枝，尤其包括类似crAss的噬菌体和携带Cas的巨型噬菌体。比较分析显示，尽管存在动物特异性特征，hcCMGV与hcPGV的亲缘关系比hcMGV更近，且55.88%的hcCMGV与人类微生物组存在关联。

结论：本研究结果揭示这三种动物肠道病毒的多样性，有助于未来使用模型动物进行肠道微生物研究。

论文ID

原名：Metagenomic analysis reveals gut phage diversity across three mammalian models

译名：宏基因组分析揭示三种哺乳动物模型中的肠道噬菌体多样性

期刊：Microbiome

IF：12.7

发表时间：2025.6

通讯作者：马迎飞

通讯作者单位：中国科学院深圳先进技术研究院

DOI号：10.1186/s40168-025-02144-4

实验设计

结果

1 来自小鼠、猪和食蟹猴肠道的DNA病毒的高置信度基因组目录

为了全面研究动物模型中的肠道病毒，研究者分别从小鼠、猪和食蟹猴肠道中收集407、980和110个公开（主要来自建立微生物目录的先前研究）或先前未公开的宏基因组（补充表S1）。为了鉴定高置信度的肠道病毒，研究者使用完善的病毒预测因子或评估因子的组合筛选1018773、3664183和440563个从头组装的重叠群（> = 10 k），即VirSorter 2、DeepVirFinder、geNomad和CheckV，具有高度保守的设置（图1a、扩展数据图1和补充表S2）。接下来，研究者将最终一组高置信度肠道病毒重叠群聚类为物种水平的vOTU。总体而言，研究者获得高置信度小鼠、猪和食蟹猴肠道vOTU的目录，称为hcMGV（n = 977）、hcPGV（n = 12896）和hcCMGV（n = 1480）。每个vOTU中最长的重叠群在下文中被指定为代表整个vOTU的质心，即vOTU的代表。图1b右侧的直方图显示，hcPGV代表株的GC含量（40.52%）相对低于hcMGV（47.53%）和hcCMGV（44.11%）（补充表S3）。

在此基础上，研究者通过CheckV评估hcMGV、hcPGV和hcCMGV代表的完整性，显示它们都至少完成90%，其中619（63.36%）、5331（41.34%）和627（42.36%）个完全完成（图1c和补充表S3）。由于候选病毒具有侧翼细菌区域，因此在目录构建过程中提前删除或警告完整性低的病毒（< 90%），以确保高可靠性（扩展数据图1）。在hcMGV、hcPGV和hcCMGV代表中，仅2个（0.20%）、47个（0.36%）和6个（0.41%）与ICTV代表基因组显示> = 95%的同一性和> = 50%的覆盖度（国际病毒分类委员会，病毒元数据资源版本20-190822_MSL37.3）。与IMG/VR v4相比，研究者在hcMGV、hcPGV和hcCMGV代表中分别发现298（30.50%）、810（6.28%）和315个（21.28%）未培养病毒基因组的扩展数据库（图1c和补充表S3），证实来自hcMGV、hcPGV和hcCMGV的大多数病毒的新颖性。

然后，研究者使用geNomad对来自hcMGV、hcPGV和hcCMGV的代表性病毒进行分类学分类，显示几乎所有基因组都被分配到不同等级的病毒。然而，大多数（960、12408和1422）被指定为Caudoviricetes纲（在生态系统中具有高丰度的有尾噬菌体），而没有进一步的信息，即：未指定的Caudoviricetes。在具有进一步分类学信息的Caudoviricetes纲的基因组中，6个hcMGV、276个hcPGV和33个hcCMGV代表被分配到Crassvirales目，这是人类肠道中最丰富的病毒（图1c）；其它分类群包括Rountreeviridae、Autographiviridae、Schitoviridae、Straboviridae、Drexlerviridae、Herelleviridae和Demerecviridae。其中，无尾病毒包括来自单链DNA病毒域（Monodnaviria）的48个病毒，以及来自多链DNA病毒界（Varidnaviria）的12个病毒。此外，1个hcMGV、33个hcPGV和2个hcCMGV代表被归类为未进一步分类的病毒（补充表S3）。

此外，研究者使用BACPHLIP（一种基于溶原性相关保守蛋白结构域的随机森林温和型/烈性噬菌体分类器）注释噬菌体的生活方式。ACPHLIP以≥95%的概率识别出，hcMGV中421株（43.09%）温和噬菌体和56株（5.73%）烈性噬菌体；hcPGV中3259株（25.27%）温和噬菌体和2196株（17.03%）烈性噬菌体；hcCMGV中541株（36.55%）温和噬菌体和167株（11.28%）烈性噬菌体，表明在这些动物的肠道中高置信度噬菌体以温和型为主。然而，51.18% hcMGV、57.70% hcPGV和52.16% hcCMGV的噬菌体无法通过BACPHLIP进行明确分类（置信概率 ≥95%）（图1c 及补充表S3）。随后，研究者使用PhaTYP对BACPHLIP的预测结果进行验证。结果表明，PhaTYP能够分别确认 BACPHLIP对hcMGV、hcPGV和hcCMGV代表株作出的69.96%、74.15%和 70.58%的烈性/温和判定。此外，PhaTYP 能够为BACPHLIP无法明确归类为温和型或烈性（置信概率≥95%）的几乎全部代表株分配生活方式（补充表S3）。

随后，研究者使用iPHoP（一种整合多方法的框架，用于可靠分配属水平的宿主分类学）预测噬菌体宿主。总计成功鉴定出64.79% hcMGV（n = 633）、41.89% hcPGV（n = 5402）和66.42% hcCMGV（n = 983）的代表性噬菌体的宿主属。其中，171个hcMGV、809个hcPGV和157个hcCMGV代表株与多个属的宿主相关联（补充表S3）。噬菌体最常见的宿主为肠道三大优势菌门，Bacillota_A、Bacteroidota、Bacillota（传统归类于厚壁菌门）（图1c），其他关联比例>0.5%的宿主菌门包括，Pseudomonadota（302 hcPGV + 42 hcCMGV）、Bacillota_C（133 hcPGV + 48 hcCMGV）、Actinomycetota（21 hcCMGV）和Spirochaetota（17 hcCMGV）。值得注意的是，研究者发现3个hcMGV、152个hcPGV 和 20个hcCMGV代表株为广宿主噬菌体，其宿主范围跨越多个菌门甚至域（补充表S3）。综上，本研究从小鼠、猪和食蟹猴肠道中分别鉴定出977、12896和1480个高置信度物种水平vOTUs，并系统表征其完整性、新颖性、分类学、生活方式和宿主关联。

图1. 从小鼠、猪和食蟹猴肠道宏基因组中鉴定出的高置信度病毒基因组。a，鉴定并聚类高置信度小鼠、猪和食蟹猴肠道vOTUs（即hcMGV、hcPGV和hcCMGV）的简要流程。详细信息见扩展数据图1及方法部分。b，hcMGV、hcPGV和hcCMGV代表株的长度与GC含量分布（n = 977、12,896、1480）。顶部和右侧直方图分别展示长度和GC含量分布。c，hcMGV、hcPGV和hcCMGV代表株的特征统计。饼图展示了病毒在完整性、相似性（与ICTV或IMG/VR数据库匹配）、分类学、生活方式或宿主分组中的分布。在hcMGV、hcPGV和hcCMGV代表株中，分别有2、47和6株与ICTV数据库匹配。

2 三种模型动物肠道中流行的病毒簇

为了研究常见病毒，研究者使用BBMap工具，将407份小鼠、980份猪和110份食蟹猴肠道宏基因组的清洁数据分别与hcMGV、hcPGV和hcCMGV代表序列进行比对，从而检测这些病毒组。结果显示，研究者在分别从小鼠、猪和食蟹猴肠道收集的宏基因组中，仅52.76%的hcMGV（n=526）、88.15%的hcPGV（n=11368）和76.08%的hcCMGV代表（n=1126）被检测到，揭示其肠道病毒组的个体特异性（图2a、扩展数据图2、补充表S3和S4）。统计分析显示，小鼠、猪和食蟹猴样本中hcMGV、hcPGV和hcCMGV代表的流行率存在显著差异（p值=0）。研究者发现，具有溶原性周期的病毒（n=4221）与具有裂解性周期的病毒（n=2416）相比，流行率显著更高（p值=0.0000003）。在这些动物肠道中，Crassvirales噬菌体（n=315）与其他分类群之间存在显著差异（p值≤0.05）。就预测宿主而言，预测感染拟杆菌门的噬菌体流行率显著高于感染其他类群的噬菌体（图2a）。

另一方面，研究者发现分别有26个hcMGV、36个hcPGV和1个hcCMGV代表在超过60%的小鼠、猪和食蟹猴肠道宏基因组中被检测到，表明这些动物肠道中存在高度流行的肠道病毒（补充表S3）。为了在更高分类层级进一步分析流行肠道病毒，研究者使用vConTACT2对hcMGV、hcPGV和hcCMGV代表序列进行聚类。基于全基因组基因共享谱，研究者在属水平上获得186个、2049个和295个病毒簇（VCs）（补充表S5）。然而，hcMGV、hcPGV和hcCMGV中分别有198个、3013个和407个代表被识别为重叠（桥接不同VC）、异常值（与其VC成员连接较弱）或单例基因组（无近缘病毒）且未被分配至任何VC（补充表S3）。随后，研究者检测肠道宏基因组中的VC，并发现hcMGV、hcPGV和hcCMGV中分别有26个、40个和5个VC在小鼠、猪和食蟹猴肠道宏基因组中表现出极高的流行率（≥60%）（图2b和补充表S6）。

此外，来自hcMGV、hcPGV和hcCMGV的前5个高流行VCs均被归类为Caudoviricetes噬菌体，但在属水平上很少与ICTV代表基因组聚类，表明它们是动物肠道中流行的新型噬菌体支系。其中一个例外是hcMGV_VC_97_0，其包含19个种级代表基因组。它与粪杆菌噬菌体FP_Mushu（Mushuvirus mushu）聚类，后者在90.66%的小鼠肠道宏基因组样本中被检测到。另一个例外是hcMGV_VC_45_1，其包含16个种级代表基因组，与粪杆菌噬菌体FP_Lagaffe（Lagaffevirus lagaffe）聚类，并在86.24%的小鼠肠道宏基因组中被检测到（图2b和c，补充表S7和S8）。上述两种ICTV代表的细菌宿主均为普氏粪杆菌（Faecalibacterium prausnitzii），这是健康成人肠道微生物群中的优势成员。其他与国际病毒分类委员会短尾噬菌体纲噬菌体略有关联的流行VCs来自Samwavirus、Vegasvirus、Yongloolinvirus、Phietavirus、Casadabanvirus、Copernicusvirus和Andhravirus属，其宿主细菌涵盖棒状杆菌属（Corynebacterium）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、梭菌属（Clostridioides）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、假单胞菌属（Pseudomonas）和肠球菌属（Enterococcus）（图2c和补充表S8）。有趣的是，研究者发现5个最流行的VCs聚为一类，即hcMGV_VC_70_0、hcPGV_VC_508_1/9/6和hcCMGV_VC_28_0，分别在小鼠、猪（96.43%/94.59%/88.27%）和食蟹猴（62.73%）的肠道样本中检测到（图2c）。这三个VC中的大多数病毒可能具有溶原性周期（n=98），且预测感染梭菌纲（Clostridia）细菌（n=46）。此外，网络分析显示，小鼠宏基因组中第5个最流行的VC（hcMGV_VC_45_1，16个成员，流行率=86.24%）与猪肠道样本中第4个最流行的VC（hcCMGV_VC_57_0，9个成员，流行率=60.91%）之间存在密切关联（图2c和补充表S8）。综上，研究者在三种动物肠道中发现高度流行的新型噬菌体支系，包括几个在不同动物肠道间具有相似性的VC。

图2. 小鼠、猪和食蟹猴肠道中流行新型病毒簇的鉴定。a，hcMGV（n=977）、hcPGV（n=12896）、hcCMGV代表（n=1480）及其连接的ICTV病毒（n=809）在属水平的蛋白质聚类网络（排除单例）。仅纳入与hcMGV、hcPGV和hcCMGV代表聚类到同一病毒簇（子簇）的ICTV病毒。节点根据其流行率、数据来源、生活方式、分类学或细菌宿主着色。箱线图中不同字母表示通过Wilcoxon秩和检验分析得出的显著差异（p值<0.001）。b，分别来自407份小鼠、980份猪和110份猕猴宏基因组的186个、2049个和295个属水平VCs的流行率，以及构成各病毒簇的病毒vOTUs数量。c，hcMGV、hcPGV和hcCMGV中前5个最流行病毒簇的蛋白质聚类网络及其连接的ICTV基因组（排除单例）。纳入与前5个最流行病毒簇成员连接的ICTV病毒（BLASTn期望值≤1e-6）。节点根据病毒簇和数据来源着色。节点大小基于所选hcMGV、hcPGV和hcCMGV代表在小鼠、猪和食蟹猴宏基因组中的流行率。标注了病毒的预测生活方式、细菌宿主、构成病毒簇的vOTUs数量，以及连接的ICTV病毒的分类学信息和细菌宿主。a和c中的网络通过vConTACT2和Cytoscape构建并可视化。节点代表病毒基因组。边宽基于节点间共享同源蛋白的数量确定的连接数。

3 hcMGV、hcPGV和hcCMGV中的CrAss样蛋白

上述对流行率的探索引导研究者聚焦于crAss样噬菌体，这类病毒被认为是人类肠道中最丰富的病毒，属于粗病毒目（Crassvirales，以下简称crass病毒）。在hcMGV、hcPGV和hcCMGV代表序列中，研究者通过geNomad工具鉴定出6个、276个和33个crass病毒，其中110个被预测感染拟杆菌门（Bacteroidota phylum）。为进一步探究这些crass病毒的基因组多样性，研究者基于主要衣壳蛋白（MCP）对其与73个ICTV分类的种级代表基因组开展了系统发育分析。无根系统发育树显示，315个crass病毒中有182个（57.78%）与Steigviridae科聚为一类（图3a、扩展数据图3和补充表S9）。为深入解析Steigviridae科的扩展基因组多样性，研究者基于共享直系同源蛋白进行了分层聚类。182个crass病毒的热图显示，其系统发育分支与15个ICTV分类的Steig病毒科基因组存在分离，提示Steig病毒科至少在属水平上存在新的分类单元（图3b和补充表S10）。综上，本研究数据揭示了三种动物肠道中crass病毒的未被探索的多样性，尤其是在Steig病毒科中（至少在属水平上）。

图3. CrAss样噬菌体在hcMGV、hcPGV和hcCMGV代表中的分析。a，基于主要衣壳蛋白（MCP）的系统发育树，包含来自hcMGV（6个）、hcPGV（269个）、hcCMGV（32个）和ICTV数据库（73个）的crass病毒。hcPGV和hcCMGV代表中分别有7个和1个未检测到MCP。节点分支末端的圆形符号根据ICTV分类的亚科着色，同科病毒聚为一类。本研究发现的crass病毒未标注节点符号。b，与Steig病毒科相关的crass病毒层次聚类分析，显示属级分离。左图：15个ICTV分类的Steig病毒科种级代表基因组的层次聚类；右图：本研究鉴定的182个crass病毒与15个ICTV基因组的聚类。聚类基于共享直系同源蛋白百分比，采用Ward.D2算法结合欧氏距离。正交蛋白通过OrthoFinder默认参数识别。与ICTV Steig病毒科基因组分离的进化分支以红色框标出（图3a，扩展数据图3及补充表S9）。该分析揭示了模式动物肠道crAss样噬菌体的扩展多样性，尤其在Steig病毒科中发现了新的潜在属级分类单元。

4 hcMGV、hcPGV和hcCMGV中的巨型噬菌体

基因组大小≥200 kb的巨型噬菌体（jumbophages）通常具有更高的功能潜力。研究者在hcMGV、hcPGV和hcCMGV代表序列中分别鉴定出21、202和22个巨型噬菌体，均属于短尾噬菌体纲（Caudoviricetes）。研究者通过BACPHLIP工具预测，其中23个和43个分别被归类为温和噬菌体和裂解性噬菌体，剩余176个功能未明（补充表S11）。研究者使用PhageScope进行的精细功能注释显示，所有巨型噬菌体均编码参与噬菌体复制、组装或包装的基因（图4a）。其他注释包括tRNA、整合、免疫、调控、裂解或感染相关基因（补充表S11和S12）。然而，约80%的基因被归类为假想蛋白或未分类，表明其功能机制仍存在显著认知空白。

此外，CRISPRminer工具从17个巨型噬菌体中鉴定出多种CRISPR-Cas系统，包括基于Cas9的II型系统（n=1）、基于Cas10的III型系统（n=1）、基于Cas14的V型系统（n=8），以及7个仅含CRISPR阵列而无关联Cas蛋白的独立系统（图4a及补充表S11）。在发现的20个Cas14候选蛋白中，7个同时含有TnpB样结构域和DNA结合结构域，与Harrington团队报道的Cas14a.1蛋白特征一致（补充表S13）。通过将7个Cas14候选蛋白与Harrington团队报道的45个Cas14蛋白进行系统发育分析，揭示该蛋白家族此前未知的多样性（图4b）。值得注意的是，CRISPR-Cas14系统以紧凑性著称（通常含400-700个氨基酸），其单效应蛋白特性为开发新型基因编辑工具提供了独特优势。令人惊讶的是，研究者发现两个仅含153和316个氨基酸的Cas14候选蛋白，这表明它们作为基因编辑工具在生物技术应用中具有广阔潜力。此外，研究者发现两个巨型噬菌体（PGV1和PGV2）编码的间隔区靶向来自同一样本或生境的细菌MAGs（图4c）。这些细菌染色体上的靶向位点编码螺旋-转角-螺旋转录调节因子或糖基转移酶，提示宿主调控功能可能发生丧失或改变，这或许在噬菌体感染过程中具有优势。研究者还在PGV1和PGV2这两个巨型噬菌体中发现另外两个编码间隔区，分别靶向其他噬菌体（巨型噬菌体PGV3和噬菌体hcPGV4），这可能增强其细菌宿主对抗竞争噬菌体的免疫武器库。此外，另一个巨型噬菌体（CMGV1）中检测到自我靶向现象，暗示巨型噬菌体中CRISPR-Cas系统的复杂性（图4c及补充表S14）。综上，本研究鉴定的巨型噬菌体展现出功能多样性，其中CRISPR-Cas系统尤为突出。

图4. hcMGV、hcPGV和hcCMGV代表群体中的巨型噬菌体。a，来自hcMGV、hcPGV和hcCMGV代表的20个、201个和21个巨型噬菌体的注释信息。层次聚类基于共享直系同源蛋白百分比，采用Ward.D2算法结合欧氏距离进行分析。直系同源蛋白通过OrthoFinder工具（默认参数）鉴定。分支上的圆点和前三个色带分别根据数据来源、生活方式和宿主门类着色，后续12个色带根据分类蛋白数量或编码基因数量着色。CRISPR-Cas系统通过CRISPRminer工具识别，并以实心星号表示。右侧条带长度基于基因组长度。b，本研究鉴定的Cas14蛋白与Harrington等人此前报道的Cas14蛋白的系统发育树。树分支根据数据来源着色，树外条带长度基于Cas14蛋白的氨基酸长度。c，展示本研究巨型噬菌体编码的CRISPR间隔区靶向关系的互作网络，箭头表示巨型噬菌体编码间隔区的靶向关系。

5 hcMGV、hcPGV和hcCMGV代表之间的比较

研究者首先在种水平上对hcMGV、hcPGV和hcCMGV代表序列进行聚类，发现仅有2个共享代表序列，其中99.08%的hcMGV、99.19%的hcPGV和93.24%的hcCMGV代表序列彼此分离，凸显了三种动物间极高的特异性（图5a和补充表S15）。在属水平上，三个动物共享80个病毒簇（VCs），使分离的VC比例分别降至48.04%、77.41%和23.68%（图5a和补充表S16）。值得注意的是，研究者在猪和食蟹猴的高置信度肠道病毒中发现了97个vOTUs和360个VCs的共享，数量远多于与小鼠的共享。研究结果表明，与小鼠相比，猪和食蟹猴的肠道病毒具有更近的亲缘关系。

接下来，为在功能水平上比较hcMGV、hcPGV和hcCMGV代表序列，研究者分别鉴定出71861个、867560个和105867个蛋白质，并将这些蛋白质与VOGDB数据库进行比对。总体而言，65.62%的hcMGV、68.34%的hcPGV和67.93%的hcCMGV蛋白质未与任何VOG显著匹配；18.82%、18.60%和18.63%被归为功能未知的低特征类别（Xu），表明这三种动物肠道病毒的功能能力尚不明确。在与VOGs匹配的蛋白质中（占比分别为34.38%、31.66%和32.07%），与病毒复制相关（Xr）和对宿主有益（Xh）的蛋白数量始终多于病毒结构相关（Xs）和对病毒有益（Xp）的蛋白质（扩展数据图4及补充表S17）。VOG注释的比较分析显示，hcMGV和hcCMGV代表携带的VOGs中，仅4.93%和7.92%未与其他病毒共享；而hcPGV仍有56.41%的特异性VOGs（定义为hcPGV中检测到但hcMGV或hcCMGV中未检测到的VOGs占hcPGV总检测VOGs的比例）（图5a）。

与vOTU、VC和功能水平的比较结果一致，流行率分析也显示猪和食蟹猴的肠道病毒具有更近的亲缘关系。研究者计算hcMGV、hcPGV和hcCMGV代表在三种动物宏基因组样本中的流行率（补充表S18）。在>1%的猪和>1%的食蟹猴肠道宏基因组中，分别检测到数量相近的hcMGV代表（18个和16个）。相比之下，>1%的食蟹猴肠道宏基因组中hcPGV代表数量（n=480）比>1%的小鼠肠道宏基因组（n=93）高出416.13%。研究结果还显示，>1%的猪肠道宏基因组中hcCMGV代表数量（n=285）比>1%的小鼠肠道宏基因组（n=37）高出681.08%，证实了与小鼠相比，猪和食蟹猴的肠道病毒相似性更高（图5b）。

最后，为探究小鼠、猪和食蟹猴肠道中被噬菌体感染的微生物，研究者从MGMGdb数据库收集的19958个小鼠、8866个猪和1047个食蟹猴MAGs或分离株中提取176956个、41891个和7659个CRISPR间隔区（补充表S19）。这些间隔区分别来自7516个（37.66%）小鼠、2252个（25.40%）猪和527个（50.33%）食蟹猴的细菌或古菌基因组中的12816个、4319个和950个CRISPR阵列，其中脱硫杆菌门_I（Desulfobacterota_I）、甲烷杆菌门（Methanobacteriota）和粘球菌门（Myxococcota）是每个基因组中间隔区数量最多的宿主门类（扩展数据图5及补充表S20）。随后，研究者通过BLASTn比对这些间隔区与hcMGV、hcPGV和hcCMGV代表序列。结果显示，hcMGV（n=41）、hcPGV（n=664）和hcCMGV（n=237）中分别有4.20%、5.15%和16.01%的病毒与来源生境不同的微生物间隔区关联。其中，研究者发现45个和208个hcCMGV代表分别与小鼠和猪肠道细菌间隔区匹配，证实猪与食蟹猴间更近的亲缘关系（补充表S21）。此外，在942个与来源生境不同细菌关联的噬菌体中，约75%未在该细菌生境中被检测到（流行率=0），表明病毒流行率与其感染偏好独立（图5c）。综上，基于种水平vOTU、属水平VC、VOG功能注释、流行率及宿主关联的多维度比较分析，全面揭示hcMGV、hcPGV和hcCMGV代表的相似性与差异性，表明尽管动物特异性高，但与小鼠相比，猪和食蟹猴的肠道病毒具有更近的亲缘关系。

图5. hcMGV、hcPGV和hcCMGV代表序列的比较及其与人类肠道微生物群的关联。a，hcMGV、hcPGV和hcCMGV代表序列间不同的及重叠的vOTUs、VCs和VOG注释。代表序列基于MIUViG推荐标准聚类为种水平vOTUs；vOTU代表序列通过vConTACT2网络进一步分组为属水平VCs；代表序列编码的蛋白质通过与VOGDB数据库比对完成注释。b，hcMGV、hcPGV或hcCMGV代表序列在407份小鼠、980份猪或110份食蟹猴宏基因组样本中的流行率。c，通过间隔区匹配鉴定的hcMGV、hcPGV和hcCMGV代表序列与来源生境不同宿主基因组的病毒关联。红色基于对应生境中的流行率着色，橙色基于与对应生境宿主基因组匹配的间隔区数量着色。d，hcMGV、hcPGV和hcCMGV代表序列与MGV目录的pident（使用BLASTn的完全匹配百分比）。折线图展示了977个hcMGV、12,896个hcPGV和1,480个hcCMGV代表序列中与MGV目录具有至少特定pident值的频率。e，hcMGV、hcPGV和hcCMGV代表序列蛋白质与MGV蛋白质的sseqid（使用Diamond BLASTp的序列一致性）。折线图展示了71861个hcMGV、867560个hcPGV和105867个hcCMGV代表编码蛋白质中与MGV蛋白质具有至少特定sseqid值的频率。f，231个、748个、501个UHGG细菌物种的系统发育树，展示其与hcMGV（左）、hcPGV（中）、hcCMGV（右）代表序列的关联。与hcPGV和hcCMGV关联的4个和2个UHGG古菌物种未在树中显示。宿主归属通过CRISPR间隔区匹配确定。分支颜色和最外层圆圈表示细菌门类；后续三个圆圈分别表示与hcMGV、hcPGV、hcCMGV代表序列关联的UHGG细菌物种；最内层圆圈表示通过与≥5个hcMGV、≥5个hcPGV或≥5个hcCMGV代表序列关联的细菌-古菌物种对。红、蓝、绿连接分别表示由≥5个hcMGV、≥5个hcPGV、≥5个hcCMGV代表序列关联的UHGG物种。

6 与人类肠道微生物组相关的hcMGV、hcPGV、hcCMGV的代表

最后但同样重要的是，研究者探究了hcMGV、hcPGV和hcCMGV与人类肠道微生物组的关联性。通过blastn比对（覆盖度≥50%），研究者将三类病毒代表序列与人类肠道病毒目录（MGV，n=189680）进行比对。结果显示，在相同百分比同一性阈值（pident）下，hcCMGV代表序列的MGV命中频率始终高于hcPGV，而hcPGV又高于hcMGV（图5d及补充表S22a）。重复实验中，研究者将三类病毒与人类肠道噬菌体数据库（GPD，n=142809）比对发现，hcMGV在相同pident阈值下的GPD命中率也显著高于hcPGV和hcCMGV（数据未展示）。研究者进一步通过diamond blastp（evalue≤1e-10）将三类病毒编码的71861、867560和105867个蛋白质与MGV基因组蛋白质（n=11837198）比对，发现在相同序列同一性（sseqid）阈值下，hcCMGV蛋白质的MGV命中频率仍持续高于hcPGV和hcMGV，但hcPGV与hcCMGV蛋白质间无显著趋势差异（图5e及补充表S22b）。这些结果表明，与小鼠和猪相比，食蟹猴肠道病毒与人类肠道病毒具有更高的相似性。

另一方面，为探究哺乳动物肠道病毒与人类肠道细菌的潜在关联，研究者通过BLASTn比对分析了hcMGV、hcPGV和hcCMGV代表序列与Nayfach等人在统一人类胃肠道基因组（UHGG）数据库中鉴定的1846441个CRISPR间隔区的匹配情况。结果显示，33.47%的hcMGV、31.32%的hcPGV和55.88%的hcCMGV代表序列与UHGG基因组存在关联（图5f及补充表S23），证实食蟹猴肠道病毒与人类肠道微生物组的关联性更强。这些关联涉及UHGG中的231种（hcMGV）、752种（hcPGV）和503种（hcCMGV）细菌物种（总计821种），主要归属于厚壁菌门_A（Firmicutes_A）、拟杆菌门（Bacteroidota）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteriota）和变形菌门（Proteobacteria）（补充表S24）。值得注意的是，部分病毒显示出跨不同门甚至域的UHGG细菌关联，表明病毒可能通过遗传物质交换跨越高级分类单元。综合来看，hcCMGV代表序列与人类肠道微生物组的关联性显著高于hcMGV和hcPGV，揭示食蟹猴可作为模拟人类肠道病毒组的更理想模型。

讨论

肠道微生物组研究长期以细菌群落为核心，尽管病毒普遍存在且可能对宿主健康产生重要影响，却常被忽视。本研究通过宏基因组学方法，分别在小鼠（977个）、猪（12896个）和食蟹猴（1480个）肠道中鉴定出高置信度vOTUs。研究者对hcMGV、hcPGV和hcCMGV代表序列的比较显示，在种水平上呈现高度动物特异性，属水平则存在中等差异。然而，研究者发现41个hcMGV、664个hcPGV和237个hcCMGV代表序列被预测可感染与病毒原生宿主不同生境的宿主，揭示了三种肠道微生物组通过病毒的潜在关联。此外，相较于小鼠（33.47%）和猪（31.32%）的病毒组，食蟹猴肠道病毒组中有更高比例（55.88%）被预测可感染人类肠道微生物组，这可能与其与人类更近的进化关系相关。另一方面，Li等人建立的食蟹猴肠道微生物基因目录显示，猕猴与人类共享的非冗余基因比例（39.49%）显著高于小鼠（5.59%）和猪（12.98%），印证了灵长类肠道菌群的相似性。CRISPR间隔区分析进一步支持这一结论：食蟹猴（5.82%）、猪（3.57%）和小鼠（2.89%）的肠道微生物CRISPR间隔区与人类肠道菌群的匹配率呈梯度差异。尽管分析表明食蟹猴是模拟人类肠道病毒组的更优模型，但需注意人类粪便菌群移植（FMT）小鼠模型在病毒组研究中的潜在价值，因其与人类菌群具有高度相似性。

2023年准备这份手稿时，研究者注意到猪病毒组数据库（PVD）的预印本已在线发布。通过仔细研究Mi等人使用的数据集，研究者发现PVD包含但未用于构建hcPGV的数据集大多发表于研究者2021年猪数据收集之后，且主要来自仔猪相关研究。然而，研究者倾向于选择不同年龄和性别猪的宏基因组数据，以减少hcPGV对特定年龄或性别的偏向性。因此，本研究最终决定不纳入这些仔猪相关数据集。尽管PVD在构建和分析过程中付出了大量努力，但研究者认为本研究通过填补不同哺乳动物模型肠道病毒的认知空白，并揭示其与人类肠道微生物组的关联，提供了新的贡献，这是PVD所未涵盖的。研究者建议未来猪病毒组研究可将hcPGV与PVD整合作为参考。Mi等人从4650份猪肠道宏基因组样本中鉴定出48299个种水平病毒操作分类单元（vOTUs，完整性>50%）。在剔除CheckV完整性<90%或存在PVD警告的vOTUs后，剩余21072个vOTUs。随后，研究者使用geNomad进一步去除推测的质粒或细菌宿主区域及低质量病毒重叠群，最终从PVD中获得19507个种水平vOTUs，比本研究的hcPGV（12896个）多51.26%。尽管本研究构建hcPGV仅纳入了21.08%的宏基因组（n=980），但其高置信度病毒基因组数量达PVG的66.11%。hcPGV与PVD的差异可能源于病毒检测流程和选择标准的不同，例如为提高病毒检测可靠性，研究者排除了metaSPAdes组装长度<10 kb的重叠群作为VirSorter2和DeepVirFinder的输入，而PVD构建中未提及此重叠群截断值（包含1.5 kb病毒）。综上，hcPGV与PGV共代表24905个高置信度种水平vOTUs，数量超过hcPGV（12896个）和PGV（19507个）单独的数量，表明两个目录的病毒多样性具有互补性。

考虑到病毒-细菌相互作用对微生物组功能的潜在影响，研究者探索感染人类病原体的哺乳动物肠道病毒，这类病毒可能促进遗传物质的水平转移。研究者发现25个hcMGV、182个hcPGV和43个hcCMGV代表属于短尾噬菌体纲（Caudoviricetes），并与包含人类病原体的细菌属（通过毒力因子数据库，VFDB记录）关联，例如梭菌属（Clostridium，n=147）、埃希氏菌属（Escherichia，n=50）和克雷伯氏菌属（Klebsiella，n=14）。BACPHLIP工具在其中鉴定出95个温和噬菌体和37个烈性噬菌体，剩余118个分类不确定。在这250个噬菌体中，77个的细菌宿主通过间隔区匹配在病毒原生宿主肠道中被检测到（补充表S26）。研究者利用CARD的RGI和VFDB数据库进行ARG和VFG鉴定，结果显示这250个病毒中无完全/严格匹配或高度保守（一致性80%，查询覆盖度80%，e值1e-10）的命中。来自哺乳动物肠道的250个噬菌体中高度保守的ARG和VFG的稀疏性表明其在ARG/VFG传播中的风险较低，提示其作为治疗人类病原体的潜在噬菌体资源的价值。然而，RGI在250个噬菌体中鉴定出20个噬菌体编码的33个ARG松散匹配（赋予对多种抗生素如氟喹诺酮类、截短侧耳素类和林可酰胺类的抗性）（补充表S27）。当将一致性和e值阈值降至25%和1e-6（而非80%和1e-10）时，250个噬菌体中74个噬菌体编码的104个VFG被鉴定（补充表S28）。这些低保守性的VFG可能参与黏附、效应蛋白递送、运动或其他致病过程。总体而言，研究者的探索表明，尽管哺乳动物肠道病毒感染人类病原体在ARG/VFG传播中的风险较低，但仍存在需要考虑的潜在风险。

在探索这些动物模型中的crass病毒时，研究者发现它们均与已知的四个科（即Steigviridae、Suoliviridae、Intestiviridae和 Crevaviridae）聚类。未发现新科可能源于研究者建立和注释这些病毒目录时使用的高度保守流程。基于标记或共享蛋白的分类学分配（迭代法）可能有助于识别更多类似crAss的新噬菌体（研究者此前曾尝试），但为遵循本研究坚持的高可信度原则，研究者选择依赖geNomad提供的更可靠分类学信息，导致crAss样噬菌体中未发现新鉴定的科。研究者承认采用的保守方法限制研究者捕捉肠道病毒组全部多样性的能力。为解决这一问题，研究者收集1645个小鼠、19623头猪和2173只食蟹猴肠道中质量病毒操作分类单元代表（mqMGV、mqPGV和mqCMGV），并利用geNomad、iPHoP和PhaTYP工具对其分类学、宿主和生活方式进行表征（补充表S29）。这些中质量数据集可为未来关注此类中质量病毒重叠群的研究人员提供有用资源。总体而言，本研究通过揭示三种哺乳动物模型肠道噬菌体的多样性和复杂性迈出了重要一步，拓展研究者对肠道病毒组及其与宿主生物学复杂互作的理解。尽管本研究聚焦于DNA病毒，但研究者认为RNA病毒可能在塑造肠道微生物群落和影响宿主健康中发挥重要作用（尽管尚未充分探索）。未来通过宏转录组数据整合动物模型中RNA病毒的研究，可更全面地理解这些模型中的病毒多样性，从而深化研究者对肠道病毒组及其与人类健康关联的认知。

结论

综上，本研究阐明三种哺乳动物模型肠道病毒的多样性。通过宏基因组分析，本研究者分别从小鼠、猪和食蟹猴肠道中鉴定出977个、12896个和1480个高置信度种水平vOTUs，为未来模式动物肠道病毒组研究提供高质量参考。蛋白质聚类网络揭示多个具有极高流行率（≥60%）的新进化枝，包括跨哺乳动物模型具有相似性的病毒簇。此外，本研究揭示模型肠道中crass病毒和巨型噬菌体此前未被探索的多样性，突显这些模型作为病毒发现的宝贵资源。值得注意的是，全面比较显示，与小鼠相比，猪和食蟹猴的亲缘关系更近。本研究结果还表明，由于hcCMGV与人类肠道微生物组的亲缘关系比hcMGV和hcPGV更近，食蟹猴是模拟人类肠道病毒组更理想的模型。未来研究可通过宏转录组数据探究动物模型中的RNA病毒，因为它们目前在hcMGV、hcPGV和hcCMGV中代表性不足。

原文链接： https://doi.org/10.1186/s40168-025-02144-4

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