研究论文

● 期刊: Nature Microbiology（IF 19.4）

● 原文链接: https://www.nature.com/articles/s41564-025-02164-8

● DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-025-02164-8

●  第一作者：范宇 

●  通讯作者：房刚（gang.fang@mssm.edu)

●  主要单位：纽约西奈山伊坎医学院 (Icahn School of Medicine at Mount Sinai)

 摘 要

准确追踪在粪菌移植（FMT）受体中稳定定植的细菌菌株对于理解菌株定植的决定因素、评估与临床结果的相关性以及指导治疗菌群的开发至关重要。虽然短读长测序推进了FMT研究，但在菌株水平的新一代宏基因组组装方面面临挑战。在此，我们介绍了LongTrack方法，该方法利用长读长宏基因组组装进行FMT菌株追踪。LongTrack比短读方法显示出更高的精度和特异性，尤其是在同一样本中存在多个菌株的情况下。我们在六例涉及复发性艰难梭菌感染和炎症性肠病患者的FMT案例中发现了648种定植菌株。此外，长读长测序能够评估在5年随访时间点定植菌株的基因组和表观基因组稳定性，揭示了可能与新宿主环境中菌株适应相关的结构变异。我们的研究结果支持使用长读长宏基因组学来追踪微生物菌株及其适应情况。

 引 言

粪菌移植（FMT）已成为一种治疗策略，它改变了复发性艰难梭菌感染（rCDI）患者的治疗模式。通过将健康捐赠者的肠道菌群移植到患者体内，FMT重新恢复了患者的肠道菌群生态平衡。FMT的潜在应用不仅限于rCDI的治疗，还扩展到了治疗更广泛的疾病领域，例如炎症性肠病（IBD）和癌症免疫治疗。

FMT过程遵循的原理是将健康的捐赠者体内多样化的细菌菌株（即肠道菌群的功能作用单元）转移到接受者的肠道中。对接受者肠道内这些菌株的精确和全面追踪对于理解促进或阻碍定植的因素至关重要，能为特定菌株与临床结果之间的关联提供关键信息。这种知识可以为开发由具有有益作用的菌株组成的明确细菌群落提供依据，以用于更安全的治疗应用。

高通量宏基因组测序研究为各种疾病中FMT菌株的植入提供了宝贵的见解，主要通过短读长测序来检测单核苷酸多态性（SNP）以及追踪受体体内移植菌株的基因簇。最近一项使用来自广泛细菌分离株库的基因组序列进行菌株追踪的研究表明，短读长方法在单个微生物样本中存在多种菌株共存的情况下会面临挑战。一旦从供体和FMT前受体中分离出个体分离株的基因组，就可以利用短读长宏基因组数据中菌株的唯一k-mers来实现可靠的追踪。然而，标准培养方法由于选择性培养基和条件的原因常常遗漏某些细菌分类群，并且在扩大大规模队列时也存在挑战。长读长测序能够对完整的、菌株级别的分辨率宏基因组组装基因组（MAGs）进行从头基因组组装，极大地补充了基于培养和短读长测序的方法。基于这一原理，我们开发了LongTrack方法，这是一种专门用于可靠地利用长读长MAGs进行菌株追踪的严格方法（图1）。我们以从FMT供体和受体处系统培养的针对rCDI的细菌菌株以及为期5年的随访数据（图1a）作为评估的基准（图1b），证明了LongTrack比短读长方法具有更高的精度和特异性，尤其是在区分微生物组样本中共存的菌株方面（图1c）。此外，通过利用菌株水平的长读长映射的优势以及细菌DNA甲基化的直接检测，我们在随访期间识别了菌株在从供体转移到FMT后续受体过程中的结构变异（SVs）和表观遗传变化（图1d）。

图1. FMT样本的描述、匹配的细菌分离株以及LongTrack的核心设计，用于可靠地追踪FMT菌株并检测移植菌株内的单核苷酸变异

a. 在为期5年的时间里，从3名FMT供体和4名FMT受体处采集了粪便样本，并在多个时间点进行了采集。Aggarwala等人在之前的一项研究中进行了广泛的细菌培养、分离基因组组装和短读长宏基因组测序，这些内容与FMT样本一同呈现。本研究还生成了长读长宏基因组测序数据。b. 从供体和FMT前受体的样本中获取长读长数据，用于从头构建MAGs（长读长MAGs）。重叠的分离基因组使得能够对长读长MAGs的可靠性进行系统评估，这构成了LongTrack的基础。c. LongTrack用于FMT菌株追踪的核心设计示意图，基于菌株水平的长读长（LR）MAGs。从供体或FMT前受体的每个菌株水平的LR MAGs中识别出独特的菌株特异性k-mers（k=31），作为标记，通过排除公共数据库中或同一FMT供体和受体中的其他基因组中存在的共同k-mers来实现。为确保特异性，仅从同一物种内多个菌株水平LR基因组的共享区域中选择独特的菌株特异性k-mers。在经过FMT受体的短读长宏基因组数据中，如果存在特定MAG的这些最终独特的k-mers（高于置信度分数；方法部分）的话，就表明相应的MAG存在于该受体样本中（显示为绿色）。d. 长读长宏基因组测序能够对供体和FMT后样本之间不同的SVs进行菌株特异性检测。创建了假定的基因型参考，并用于在每个样本中定位和量化特定的SV，从而能够追踪宿主之间或随时间的变化情况。长读长方

结果

高纯度、菌株级别的长读长MAGs为LongTrack提供了坚实基础

在FMT过程中进行菌株追踪的成功，取决于在移植前从供体和受体中获取能够区分不同菌株的高纯度、菌株特异性的基因组，从而能够区分同一物种中共存的菌株。

细菌分离是实现这一目标的有效方法，因为对单个菌落进行测序能够获得纯度高、完整的独立基因组。基于这一原理，我们利用超过1000个已单独组装基因组的细菌分离株集合作为基准数据，来评估长读长MAGs及其在FMT菌株追踪中的准确性。我们从4例rCDI（3名捐赠者和4名受者；补充表1）的FMT案例中选取了184种独特的菌株（105个物种），这些菌株都具有单独组装的基因组（补充数据图1）。我们为15个样本生成了长读长测序数据（补充表2），并对两个样本进行了更深入的短读长测序，以便使用LongTrack进行系统评估（补充表3）。

为了构建具有菌株水平的长读长MAGs，我们采用了专为长读长测序数据设计的流程，包括宏基因组组装、单倍型分型和菌株水平的细化处理（扩展数据图2；方法）。从这4个案例中，我们总共获得了460个长读长MAGs（460个菌株，涵盖312个物种）（补充表4），其中包括与培养分离株共有的60个菌株（图2a）。由于供体1（D1）拥有最多的细菌分离株（136个独特的菌株），我们专注于D1以展示长读长相对于短读长在MAGs从头组装方面的优势（补充表3）。我们从D1获得了135个短读长MAGs（图2b），并使用metaSPAdes从受体1（R1）获得了20个短读长MAGs，这与MEGAHIT相比表现更优（补充图1）。对460个长读长MAGs（来自所有4个案例）和155个短读长MAGs（来自D1和R1）进行CheckM污染分析，结果显示长读长MAGs的污染率更低，且片段N50值更高（图2c、d）。具体而言，对于D1，组装过程产生了124个长读长MAGs和135个短读长MAGs，其完整性相当（扩展数据图3a）。尽管短读长数据在测序深度方面具有优势，但长读长MAGs仍然始终显示出显著更低的污染率（扩展数据图3b）以及更大的N50值（扩展数据图3c）。这些发现与之前的研究结果一致，这些研究表明长读长测序在许多微生物组样本的从头宏基因组组装中具有优势。

图2. 高纯度、菌株级别的长读长MAGs为LongTrack提供了坚实基础

a. 维恩图展示了来自3个供体和4个受体的通过长读长（LR）MAG（黄色）或细菌培养物分离基因组（红色）所获得的菌株数量。左侧柱状图展示了通过MAGs获得的物种实例，这些物种的相对丰度处于中等至较高水平，但通过培养法却未被发现；而右侧柱状图则展示了通过培养获得但通过长读长测序未被挖掘的分离菌株实例，因为它们的丰度非常低。b. 该维恩图展示了在D1中可以通过LR MAGs（黄色）、短读长（SR）MAGs（蓝色）或分离基因组（红色）恢复的菌株数量。LR MAGs包括通过SR MAGs获得的所有23个菌株，以及8个未通过短读长测序组装的额外菌株。c. 使用CheckM软件对460个LR MAGs（来自供体1-3和受体1-4）和155个SR MAGs（来自D1和R1）的污染水平进行评估，结果显示LR MAGs的污染程度显著更低（P = 0.0048；two-sided Wilcoxon rank-sum test；** P <0.01）。d. LR MAGs（来自供体1-3和受体1-4）和SR MAGs（来自D1）的相对丰度分布（对数尺度）和contigN50（千字节）的分布。e. 对LR和SR菌株基因组以及来自D1的单个菌株基因组的目级别分类学比较。f. 对来自1-3号供体和1-4号受体的60个LR菌株基因组（以及来自D1的23个SR菌株基因组）进行的污染程度评估，涵盖了不同物种，且每个物种仅使用一个菌株或多个菌株进行检测。LR菌株基因组始终显示出更低的污染程度（单菌株情况下的P = 0.0007；多菌株情况下的P = 0.0086；对平均差异的双侧排列检验，n = 10，000次排列；**P<0.01）。污染程度通过将LR和SR菌株基因组映射到其对应的单个菌株基因组上，并计算未对齐的碱基百分比作为污染程度的衡量标准来评估。g. LR测序在从同一物种中区分多个共存菌株方面具有独特的优势，而SR测序则不具备这一优势。

在我们的深入评估中，我们将这些MAGs与分离菌株的基因组进行了比较。对于D1来说，长读长和短读长MAGs分别共享了31个和23个分离菌株的基因组（图2b）。长读长MAGs包括由短读长MAGs检测到的所有23个MAGs以及另外8个菌株（图2b）。长读长和短读长MAGs都涵盖了相同的17个分类学纲，其中8个仅通过MAGs检测到（图2e）。此外，所有与分离菌株基因组重叠的MAGs，包括60个长读长MAGs（涉及4个案例）和23个短读长MAGs（来自D1），都被用于评估长读长MAGs与短读长MAGs相比的可靠性（补充表5）。首先，我们通过将MAGs映射到其对应的分离菌株基因组来评估其污染水平（图2f和补充数据图4a），这种方法比CheckM的估算提供了更可靠的见解（补充数据图4b）。长读长MAGs的污染水平（1.34%）低于短读长MAGs（4.77%），对于单个和共存的菌株，两种物种的情况都是如此（图2f和补充数据图4c、d）。我们进一步评估了MAGs与其对应分离菌株基因组之间的k-mer相似度，结果始终表明长读长MAGs表现出更高的相似度（扩展数据图4e）。重要的是，长读长测序从同一捐赠样本中恢复的菌株数量与细菌培养相同，而这些共存的菌株在短读长MAGs中并未完全恢复（图2g）。我们还从60个共享的分离菌株基因组中鉴定出11个质粒，其中7个质粒（补充表6）包括一个环状质粒，是从长读长测序中恢复的。然而，这7个质粒中的任何一个都不能与对应的染色体正确归类，这凸显了质粒归类仍然是一个挑战，并且需要更专门的方法，如Hi-C。虽然共享菌株证明了长读长MAGs的可靠性，但宏基因组学和细菌分离方法之间的固有差异仍然存在。具体而言，长读长MAGs更倾向于包含相对丰度适中至较高的菌株，例如Akkermansia muciniphila（0.63%）和Faecalibacterium prausnitzii（3.94%），而细菌培养则倾向于选择通过培养基筛选出来的菌株，而非基于丰度来选择，例如丰度低于0.01%的Escherichia coli（图2a）。在D1中，分别有37.1%和65.9%的MAGs读段能够与分离菌株基因组和长读长MAGs进行比对（方法），其中76%能与合并的参考序列（分离菌株基因组和长读长MAGs）进行比对（补充图2）。有趣的是，这31个共有的菌株占宏基因组读段的30.7%，这是因为它们的丰度相对较高，这突显了长读长MAGs与细菌培养之间的互补性。

LongTrack能够可靠地利用长读长MAGs来精确追踪FMT菌株

一旦将单个分离的基因组进行组装，就可以利用从分离基因组中选取的唯一k-mers（n=31）以及对FMT后样本的短读长测序来可靠地进行菌株追踪，从而为评估LongTrack提供了真实数据。这种基于k-mers的策略（Strainer）与几种基于SNP的方法（包括inStrain、StrainFinder和ConStrains）相比表现更优，尤其适用于中等至低丰度的菌株以及多种共存的菌株。我们对LongTrack的独立评估证实，基于k-mers的方法比基于SNP的方法（StrainFinder）更灵敏，而后者往往会遗漏中等至低丰度的菌株（扩展数据图5）。

然而，Strainer并不适用于长读长的MAGs，因为这些片段通常包含不完整的MAGs（丰度中等至较低的分类单元），这可能会导致错误的菌株追踪。因此，为了可靠地使用长读长MAGs进行FMT菌株追踪，我们开发了LongTrack系统。对于同一份粪便样本中同时存在的相似菌株，或者在供体样本和受体FMT前样本中各自存在的两个相似菌株，我们仅从它们共同的基因组区域选择唯一的k-mers（图1c）。这种调整避免了那些可能对某个菌株而言看似独特的但实际上是不存在的k-mers，这是因为长读长的MAGs存在不完整性——这凸显了高纯度但不完整的长读长MAGs与完整的分离菌基因组之间的关键差异（方法）。本研究比较了在多个共存菌株中用于菌株追踪的唯一k-mers的数量，使用的是原始的Strainer（具有高完整性的分离菌基因组）与LongTrack系统（具有高纯度的长读长MAGs）（图3a）。尽管LongTrack通常比Strainer保留更少的唯一k-mers，但它在FMT后的样本中仍保留了足够的信息进行可靠的菌株追踪（图3b）。此外，我们还通过将长读长MAGs与分离菌株基因组的集合作为参考，对LongTrack和基于培养的菌株追踪方法的敏感性进行了比较。具体而言，在评估不同丰度范围内的敏感性时，LongTrack对丰度相对大于0.01的菌株显示出了100%的敏感性，并在0.001和0.01的范围内保持了83%的敏感性，而基于培养的菌株追踪方法在这些范围内遗漏了许多分类群。然而，对于超低丰度菌株（<1×10⁻⁴），LongTrack的敏感性急剧下降，而基于培养的方法则达到了98%以上的敏感性（扩展数据图6）。这些结果表明，LongTrack能有效地捕获丰度为中等至较高的菌株，而基于培养的方法则能更好地检测非常低丰度的分类群。这项评估突显了这两种方法在FMT菌株追踪方面的互补性。

图3. 对FMT菌株追踪用LongTrack技术的评估

a. 在存在多种共存菌株的情况下，原始Strainer方法（对分离株的完整基因组进行了组装）和LongTrack方法（使用长读长MAGs）用于菌株追踪所使用的独特k-mers数量。尽管LongTrack方法会过滤掉一些来自共享区域的k-mers，但仍有足够的独特k-mers用于FMT后样本的可靠菌株追踪。b. 使用LongTrack方法结合长读长MAGs（供体1-3和受体1-4）与Strainer方法结合短读MAGs（D1）进行菌株追踪的精确度和特异性比较。在3个供体和4个受体（多个粪便采样时间点，共326个独特的菌株存在/不存在事件）中，使用长读长MAGs的LongTrack方法达到了高精确度（1.00）和特异性（1.00）。相比之下，使用短读长MAGs的“筛选器”方法（n=186）显示出较低的精确度（0.96）和特异性（0.33）。c. 由从真实情况中选择的菌株特异性独特k-mers（使用分离株基因组的“筛选器”方法、使用长读长宏基因组的“长轨迹”方法或使用短读长MAGs的Strainer方法）确定的FMT后受体中的菌株存在（绿色）或不存在（灰色）。与真实情况的差异用“X”标记表示。c-e. 对4例rCDI的FMT案例（D1→R1（c）、D1→R2（c）、D2→R3（d）和D3→R4（e））进行了应变追踪的评估。f. 使用模拟的内插数据（代表供体样本中同一物种的多种菌株共存的情况）对FMT应变追踪的LongTrack进行评估。具体而言，我们在D1中添加了3个Phocaeicola massiliensis（Str1-3）菌株，并在FMT前的R1中添加了第4种P. massiliensis（Str4）菌株。所有4种菌株都添加到了FMT后的受体R1中。g. 使用模拟的内插数据（代表供体和FMT前样本之间存在高度相似菌株的情况）对FMT应变追踪的LongTrack进行评估。具体而言，我们从10个不同的物种中选取了10个具有高相似性（ANI > 99.5%）的菌株对，分别将一个菌株添加到D1中，另一个添加到FMT前的受体R1中，所有10个对均如此操作。所有20种菌株都添加到了FMT后的受体R1中。

我们还对基于LongTrack的菌株追踪精度和特异性与使用长读长MAGs的Strainer（针对D1案例）进行了比较，同时考虑了多个粪便采样时间点（每种情况各一个）。当使用共享分离株基因组作为基准时，LongTrack在4个案例中均实现了极高的精度（1.00）和特异性（1.00）（图3b），而使用短读长MAGs的Strainer的精度较低（0.96），特异性也低得多（0.33）（图3b），这可能是由于错误的追踪以及未能检测到共存的菌株（图3c）所致。基于两个已充分描述的FMT案例（D1→R1和D1→R2），我们发现LongTrack与长读长MAGs的基准结果在所有31个共享菌株的菌株追踪结果上完全一致（图3c）。相比之下，使用短读长MAGs的Strainer正确追踪了23个（74%）菌株，但在FMT后的样本中未能追踪到其余8个菌株，因为它无法区分同一供体样本中同时存在的多个菌株。此外，使用短读长MAGs的Strainer因高污染产生了6个假阳性结果。例如，短读序列的微生物组分类单元Bifidobacterium adolescentis污染水平为8.76%，其中28%的污染来自同一样本中的Bacteroides vulgatus（图S3补充图）。这导致了不准确的k-mers和错误的追踪结果（图3c）。将LongTrack应用于另外两个rCDI FMT病例（D2→R3和D3→R4）也显示出了很高的精度（图3d、e）。我们在计算机模拟中使用了两个模拟的FMT植场景进行了额外的评估（方法）。在第一个评估中，我们在D1中加入了3个P. massiliensis（Str1-3）菌株，并在预移植的R1中加入了第4种P. massiliensis（Str4）菌株；所有4种菌株都存在于移植后的R1中（图3f）。LongTrack恢复了所有4种菌株，并在移植后的R1中准确地追踪了它们，而短读序列的微生物组分类单元仅恢复了其中的两种菌株（图3f）。在第二个评估中，我们加入了与D1和预移植的R1高度相似的十个菌株对。所有20种菌株都被添加到移植后的R1中（图3g）。LongTrack正确地追踪了所有菌株，而短读序列的微生物组分类单元遗漏了两种（图3g）。

LongTrack有助于更深入地了解rCDI和IBD患者菌株植入情况

基于对基于LongTrack的FMT菌株追踪的可靠性评估结果，我们扩大了菌株追踪的范围，以更全面地了解FMT中的菌株植入情况。在所有4例rCDI的FMT案例中，长读长测序发现了396个MAGs，其分类学分布多样（图4a和补充表4），而此前基于培养的研究并未捕获到这些内容。

图4. LongTrack在6例患有rCDI和IBD患者FMT病例中发现了数百种已植入的菌株

a. 长读长MAGs的多样分类分布在Aggarwala等人之前的研究中未被培养出来。b. 在为期5年的随访中，不同时间点的个体FMT接受者的供体菌株的比例植入率（PEDS）情况。c. 在为期5年的随访中，不同时间点的个体FMT接受者的PPRS情况。d, e. 对两个IBD患者（R5和R6）的FMT案例的PEDS和PPRS分析，其中使用了3种颜色来分别代表来自两个供体（D4和D5）或受体的菌株。f, g. 在两个患有IBD的患者（R5, f; R6, g）中，FMT治疗后（源自两个供体（D4和D5）或受体）是否存在共存菌株的情况。

我们使用LongTrack方法来测量供体菌株在受体体内植入的情况，重点研究了未培养的菌株（补充表7-10）。我们采用了供体菌株的比例植入率（PEDS）来汇总FMT后5年内菌株的植入情况。我们发现供体菌株的植入情况稳定且一致（图4b），PEDS值与培养菌株相当（扩展数据图7a）。在这些个体中，我们报告了第一周未培养菌株的平均PEDS为98%，8周时稳定在约96%，甚至5年后仍保持在63%。这表明FMT能够使患有rCDI的患者体内供体未培养菌株实现稳定的长期植入。我们还使用比例受体菌株持久性（PPRS）监测FMT后受体菌株的持续存在情况。我们观察到FMT后受体菌株的PPRS显著降低（47%），无论是培养菌株还是未培养菌株（图4c和扩展数据图7b），这表明FMT后肠道微生物群发生了重大变化。在经过FMT后的R1组中，艰难梭菌的缺失值得关注，这表明这种移植导致了更平衡且有益健康的肠道微生物群落的形成（扩展数据图8a）。

我们对从供体-受体对中恢复出的长读长MAGs的个体轨迹进行了分析（扩展数据图8及补充表7-10），并发现了一些在5年后仍能在受体中稳定植入的菌株，这些菌株可能与人类健康和疾病有关。其中一个显著的例子是A. muciniphila，它存在于D1和D2中，是一种能分解黏蛋白的细菌，与多种健康益处和改善治疗效果有关。它通过调节肠道微生物群和代谢产物来防止艰难梭菌过度生长，并支持肠道屏障的完整性以及反应。D1和D2中的A. muciniphila菌株在FMT后期受体中表现出稳定的植入，其持续性可观察到长达5年（扩展数据图8a. b）。F. prausnitzii是另一种仅通过长读长MAGs得以清晰分辨的物种，它通过产生短链脂肪酸与人类健康相关，并且可能在维持肠道健康和预防IBD方面发挥作用。D1中的F. prausnitzii菌株在FMT后8周的受体中被检测到，但在FMT后5年的受体中未被检测到（扩展数据图8a）。

接下来，我们使用LongTrack方法将追踪分析扩展至来自FMT后样本的菌株，并对这些菌株在更早的时间点进行了反向追踪（方法说明）。这种方法能够捕捉到在供体样本或FMT前样本中丰度较低但在FMT后样本中有所增加的菌株，从而能够从长读长数据中对其进行组装。实际上，这种设计帮助我们识别出了35种新的菌株（扩展数据图9a-c）。所有这些情况都有明确的证据表明它们要么源自供体样本，要么源自FMT前样本，但由于其丰度较低，无法通过长读长测序获得。有趣的是，我们还从FMT后接受者身上发现了之前未被检测到的菌株，但没有证据表明它们在任何更早的时间点（无论是供体还是FMT前）存在（扩展数据图9d-f）。例如，在FMT后5年的R1样本中仅存在一种Acidaminococcus intestini（扩展数据图9d），它很可能是在第8周到第5年之间从环境中获得的，除非其在所有更早的时间点的丰度都低于检测限。

我们还将LongTrack应用于2个FMT案例中，用于治疗IBD（补充表11），这些案例中的患者是FMT前受体，其微生物群比患有rCDI患者更为复杂。患有IBD 2名患者（R5和R6）分别接受了来自6位捐赠者的粪便样本（D4到D9）（扩展数据图10），因为在FMT治疗IBD时通常会使用多个捐赠者。这种更复杂的FMT为展示LongTrack在菌株追踪方面的效力提供了绝佳的机会。我们对其中2位捐赠者（D4和D5）以及2名FMT前受体（补充表12）进行了长读长测序，并恢复了188个MAGs结构基因（补充表13）。在这些菌株中，来自2位捐赠者的64%和35%的菌株分别成功在16周后的FMT前受体中定植（图4d、e及补充表14和15）。我们还计算了PPRS，并观察到来自FMT前受体的80%和96%的菌株存在于16周后的FMT前受体中（图4d、e）。与同期患有rCDI的FMT治疗病例相比（8周时），我们发现IBD患者接受FMT治疗后的PEDS水平更低，而PPRS更高，这与预期结果一致，即患有IBD的患者在接受FMT引入供体菌株后，其肠道微生物群更加多样化且更具适应性。在2名接受FMT治疗的IBD患者中，我们观察到共存在19种和20种菌株（来自供体和FMT治疗前的受试者）（图4f、g）。值得注意的是，尽管FMT治疗前受试者的几乎所有菌株在FMT治疗后的16周内保持稳定，但一些供体菌株无法检测到，这表明IBD患者体内的内源性菌株在相同的宿主体内即使在接受FMT后也具有适应性。

对FMT后样本进行长读长测序发现移植菌株内的基因组SVs

理解供体菌株如何适应受体的微生物群落环境至关重要，因为这种适应过程可能会引发一些尚未得到充分研究的基因组变异。长读长测序在复杂结构变异的检测以及直接检测DNA甲基化方面具有显著优势，能够评估供体菌株和FMT后个体菌株中结构变异和DNA甲基化的稳定性和动态变化情况。

对接受FMT后不同时间点受体的长读长测序数据进行系统分析，发现了38个SVs，其中包括6个缺失、20个插入和12个倒位，这些结果均符合严格的筛选标准（方法）。对SV区域的读取比对进行比较后发现，2种长读长测序方法都提供了清晰且一致的侧翼序列比对（图5a），这表明它们来自同一菌株，而短读长测序图则显示存在若干不匹配，使得难以可靠地将这些序列归因于同一菌株（图5a）。在这38个SVs中，有12个在我们能够从供体和接受FMT的受体样本中分离出的4个菌株中被发现（补充表16），这使我们能够验证这些SVs。对这些培养菌株的长读长测序证实了供体和接受FMT的受体菌株确实是同一菌株，其全基因组平均核苷酸一致性（ANI）（> 99.9%）很高（补充表17）。在这12种单核苷酸SV中，有11种（占91.67%）确实存在于同一菌株中，这一结果通过对供体样本和FMT后样本的长读长测序得到了验证，表明使用长读长测序在同一种菌株内检测SV具有很高的可靠性（图5b和补充图4）。

图5. 长度长测序揭示了rCDI FMT后菌株复杂的SVs

a. 整合基因组学查看器（IGV）所绘制的图表展示了长读长在检测同种内SV方面的优势，包括在Parabacteroides merdae中发现的43个碱基对的缺失以及在Alistipes putredinis中发现的1250个碱基对的插入，这些都优于短读长测序。SV的侧翼序列在所有长读长的IGV图表中都显示出清晰且一致的对齐，这表明它们来自同一菌株。相比之下，短读长图表显示了若干不匹配之处，使得难以可靠地确定这些序列是否属于同一菌株。b. 总结了在FMT后早期和晚期时间点从供体和受体中检测到的SV的热图，包括倒位（INV）、缺失（DEL）和插入（INS）。在特定SV区域覆盖不足的样本用星号标记。在供体和受体的分离物中确认的SV用蓝色十字标记。SV还根据其位置分类：基因间区域（IR）和基因区域（GR）。c. 不同时间点供体和受体中SV基因型频率变化的示例。（1）在Bacteroides stercoris中的倒位；（2）在A. putredinis中的缺失现象在粪便微生物移植（FMT）后的早期（E）和晚期（L）阶段都会导致基因型频率的变化；（3）在Gemmiger formicilis中的插入现象仅在FMT后的晚期阶段出现基因型频率的变化。饼状图展示了在FMT后早期和晚期时间点，供体（D1或D2）和FMT后受体（R1或R3）的基因型频率。d、在P. merdae的限制性内切酶S亚单位中，存在一个涉及六个基因型的复杂倒位（shufflon），该倒位位于RMS系统中。基因型频率会随着基因型6的显著变化而变化，即在供体中不存在，在FMT后增加。e. 在供体和FMT后受体（R1或R3）的P. merdae菌株中检测到了DNA腺嘌呤甲基化（6mA）模式，这些模式在不同的时间点存在于供体和FMT后受体中；CA6mAYNNNNNNRTC对应于这个RMS阶段变体的基因型6，只有在FMT后才能检测到。f. 在几个单菌株中检测到的DNA甲基化模式表明供体（D1）和FMT后受体（R1）随着时间的推移在表观基因组方面具有稳定性。

值得注意的是，在TonB依赖性受体基因或其上游区域中发现了五个SV（图5b）。这些基因对于革兰氏阴性菌的铁转运至关重要。这些基因中的缺失可能与免疫介导的选择压力有关。在FMT后期，B. stercoris D1在susC基因中表现出高频倒位，这可能与在新宿主环境中的免疫适应有关（图5c）。在A. putredinis D1中，观察到IS110家族转座酶基因（ISCaa7）的缺失在FMT后具有高流行率（图5c），这可能会影响遗传多样性、进化和抗生素耐药性的传播，突显了其对微生物适应性的影响。此外，在G. formicilis D2中，靠近yesO基因（图5c）的插入，该基因编码ABC转运蛋白底物结合蛋白，可能在营养摄取和代谢过程中发挥重要作用。

我们还观察到了一些涉及细菌限制修饰系统（RMS）的复杂结构变异（SV），该系统通过切割未甲基化的外来DNA并甲基化自身DNA来保护细菌基因组。这些SV可以改变DNA甲基转移酶（MTases）的活性或特异性，从而驱动全基因组甲基化变化，调节基因表达并增强表型多样性，促进细菌对抗生素和宿主免疫反应的适应。长读长测序能够同时以单分子分辨率检测SV和DNA甲基化，从而将RMS基因型与甲基化基序相联系，揭示SV对表观基因组的影响。例如，我们检测到了跨越P. merdae的I型RMSS亚基的复杂SV。嵌套的反向重复序列在六种不同基因型之间造成了复杂的基因组重排（图5d）。值得注意的是，供体中占主导地位的基因型5在FMT后急剧减少，而供体中不存在的基因型6在FMT后显著增加。由于S亚基决定了MTases的序列识别基序，该RMS位点的基因型转换可以造成全基因组甲基化变化41。为了验证这一假设，我们使用了PacBio测序数据，这种数据在单分子分辨率检测6-甲基腺嘌呤（6mA）方面具有优势，确实观察到在移植后样本中存在一种DNA甲基化基序CA6mAYNNNNNNRTC（图5e）。这表明某些结构变异能够影响全基因组范围内的甲基化变化，并可能帮助P. merdae适应受体的肠道环境。此外，我们利用高覆盖度的Nanopore长读长数据对10个单菌株中的11种独特的II型甲基化基序进行了检测（图5f），其中包括1种5-甲基胞嘧啶（5mC）基序、2种4-甲基胞嘧啶（4mC）基序和8种6mA基序。这些基序在供体和受体的不同时间点均表现出一致性和稳定性。

讨 论

在这项研究中，我们提出了LongTrack方法，该方法利用长读长测序技术实现精准的FMT菌株追踪，填补了微生物菌株高分辨率追踪方面的空白。

LongTrack的一项关键方法创新在于从长读长MAGs中严格筛选出菌株特异性的k-mer，这与高纯度但有时不完整的长读长MAGs（针对低丰度菌株）相兼容，这与单独组装的细菌分离株基因组不同。LongTrack包含一个关键步骤，即仅保留源自FMT捐赠者和受赠者样本中同种菌株间共享的组装基因组区域的特异性k-mer。一旦从长读长MAGs中可靠地筛选出菌株特异性的k-mer，后续的菌株追踪就可以使用短读长微生物组测序数据可靠地进行。该LongTrack框架通过与基于大规模细菌培养的分离株基因组的Strainer的真实情况进行了验证。

尽管标准培养方法由于培养基的选择性往往遗漏某些细菌类群，但之前的基于分离株的方法对于方法评估而言仍具有重要价值。例如，尽管在更严格的条件下可以从粪便样本中培养出A. muciniphila和F. prausnitzii，但在标准培养条件下却未能培养出来。然而，我们研究中纳入分离株基因组的主要目的是将长读长MAG的LongTrack与短读长MAG的Strainer进行比较，尤其是在解决共存菌株方面。重要的是，纯且完整的分离株基因组组装为评估菌株追踪提供了一种可靠的方法。

值得注意的是，一些完整度较低（<50%）的MAGs仍与相应的培养分离株表现出较高的平均核苷酸一致性（>99.6%）和k-mer相似度（>92%）（补充表5）。例如，Bacteroides caccae的部分MAGs（499 kb）包含足够的独特k-mer，能够利用LongTrack在FMT后的样本中进行准确的菌株追踪（图3c）。使用LongTrack进行有效菌株追踪的测序深度具有灵活性，受微生物复杂性和菌株丰度的影响。对于D1，我们生成了23 Gb的长读长数据，以最大限度地恢复与培养分离株共享的菌株，并进行可靠的比较。然而，D2和D3分别仅使用18 Gb和15 Gb的数据就获得了始终准确且可靠的追踪结果。

将LongTrack应用于rCDI和IBD的FMT病例，证明了其在不同微生物组复杂性中的适用性。由于样本量相对较小，本研究主要是为了评估方法并展示其广泛适用性，而非得出关于菌株定植的普遍结论。未来针对大规模队列的研究可以进一步探究菌株丰富度对定植动态的影响及其治疗意义。

本研究还试图评估供体菌株在受体体内适应新的微生物和宿主环境时的基因组动态变化。近期的研究强调了除SNVs外，SV在微生物组适应过程中的重要性。然而，短读长测序在纵向样本中检测菌株水平的SV存在挑战，而长读长测序则能更好地应对这一问题。长读长在检测诸如shufflon（一种动态DNA倒位系统，已知能通过产生结构多样性影响细菌适应性）等复杂SV方面具有优势。基于FMT后5年内收集的纵向样本，我们使用严格的筛选标准（要求高置信度比对的覆盖深度大于5）鉴定出38个SV，并注意到SV分析依赖于测序深度，更深入的测序数据可能会检测到更多的SV。

尽管LongTrack能够提供一些见解，但在恢复超低丰度菌株方面仍存在局限性。为缓解这一问题，我们提出了两种互补策略：首先，将长读长测序与培养基方法相结合，以更全面地了解FMT菌株的植入情况；其次，应用靶向富集方法，例如流式细胞术或细菌甲基化组模式，有选择地对低丰度分类群进行测序和分析，从而提高其恢复率和追踪能力。

随着长读长测序平台成本的持续降低，我们预计LongTrack将在FMT研究中广泛用于高分辨率菌株追踪，从而更好地理解FMT，并开发出更有效的定义生物疗法。更广泛地说，LongTrack可以支持其他生物医学研究中的精确菌株追踪，以增进我们对菌株传播、基因组和表观基因组变异及其在健康和疾病中作用的理解。

作者简介

范宇（第一作者）

● 美国西奈山伊坎医学院，博士后研究员。

房刚（通讯作者）

● 美国西奈山伊坎医学院。主要研究方向：（1）病原体、微生物群与人类的表观基因组：尚未充分探索的新研究方向；不再局限于胞嘧啶甲基化，而是将研究范围拓展至其他大量未被研究的DNA甲基化、DNA损伤等方面，以及更广泛的核酸修饰形式。（2）三代测序：新技术带来了前所未有的机遇；单分子技术；长读长，> 20kb；实时检测；PacBio + Oxford Nanopore，与w/ Illumina整合；具有独特潜力来检测核酸修饰、复杂结构变异以及全长转录本等。（3）多尺度系统生物学：基因相互作用和调控网络，强调了无论是大规模还是“小规模”的数据方法，无论是“简单”还是深度学习，都与创新技术及实验相结合。实验室网站: http://fanglab.bio。发表论文70+篇，被引3983次，h指数32。个人主页：https://scholars.mssm.edu/en/persons/gang-fang/。

宏基因组推荐

• 9月12-14日，高级转录组分析和R语言数据可视化
  

• 10月18-19日，微生物组-扩增子16S分析

• 11月15-16日，微生物组-宏基因组分析

本公众号现全面开放投稿，希望文章作者讲出自己的科研故事，分享论文的精华与亮点。投稿请联系小编（微信号：yongxinliu 或 meta-genomics）

iMeta高引 fastp PhyloSuite ImageGP2 iNAP2 ggClusterNet2
iMeta工具 SangerBox2 美吉2024 OmicStudio  Wekemo OmicShare
iMeta综述 高脂饮食菌群 发酵中药 口腔菌群 微塑料 癌症 宿主代谢

10000+：扩增子EasyAmplicon 比较基因组JCVI 序列分析SeqKit2 维恩图EVenn

iMetaOmics高引 猪微生物组 16S扩增子综述 易扩增子(EasyAmplicon)

系列教程：微生物组入门 Biostar 微生物组  宏基因组

专业技能：学术图表 高分文章 生信宝典 不可或缺的人

点击阅读原文